Western blot SOP

Western Blot (WB) SOP

原理：Western blot 是一项通过凝胶电泳按照分子量大小分离蛋白，然后再利用特异性抗体识别这些蛋白的技术。免疫检测通常使用由硝酸纤维素或PVDF（聚偏二氟乙烯）制成的膜。将凝胶紧贴膜放置，蛋白在电流作用下从凝胶迁移到膜上。然后利用目标靶点特异性抗体对膜做进一步处理，再通过二抗和检测试剂让膜显色。
溶液与试剂：

NP-40 缓冲液

   150 mM 氯化钠

   1.0% NP-40（或0.1% Triton X - 100）

   50 mM Tris-HCl，pH 8.0

 蛋白酶抑制剂

RIPA缓冲液

   150 mM 氯化钠

   1% IGEPALCA - 630

   0.5% 脱氧胆酸钠

   0.1% SDS（十二烷基硫酸钠）

   50 mM Tris-HCl，pH8.0

 蛋白酶抑制剂

Tris-HCl

   20 mM Tris-HCl

 蛋白酶抑制剂

Laemmli 2X缓冲液/上样缓冲液

   4% SDS

   10% 2-巯基乙醇

   20% 甘油

   0.004% 溴酚蓝

   0.125M Tris-HCl

   测定pH值并将pH值调整至6.8

电泳缓冲液（Tris-Glycine/SDS）

   25 mM Tris base（三羟甲基氨基甲烷游离碱）

   190 mM 甘氨酸

   0.1% SDS

   测定pH值并将pH值调整至8.3

转膜缓冲液（湿转）

   25 mM Tris base（三羟甲基氨基甲烷游离碱）

   190 mM 甘氨酸

   20% 甲醇

  测定pH值并将pH值调整至8.3

   对于大于80kDa的蛋白，建议SDS终浓度为0.1%。

转膜缓冲液（半干转）

   48 mM Tris base

   39 mM 甘氨酸

   20% 甲醇

   0.04% SDS

封闭缓冲液

   1 3% 牛奶或BSA（牛血清白蛋白）

   加入TBST缓冲液。充分混合后过滤。不过滤可能会有斑点沉积，这种小暗点会在显色时影响实验结果。

样本裂解

细胞培养裂解液的制备

1.       将细胞培养皿放置冰上并用冰冷的PBS洗涤细胞。

2.       吸出PBS，然后加入冰冷的裂解缓冲液（每10⁷个细胞/100 mm培养皿/150 cm²烧瓶加1mL；每5x10⁶个细胞/60 mm培养皿/75 cm²烧瓶加0.5 mL）。

3.       用预冷的塑料细胞刮刀将贴壁细胞从培养皿上刮下，然后轻轻将细胞悬液转移到预冷的小离心管中。或者，用胰蛋白酶消化细胞并用PBS洗涤细胞，然后将细胞重悬浮于小离心管内的裂解缓冲液中。

4.       4℃下持续振摇30分钟。

5.       放入微型离心机，在4°C下离心。您可能需要根据细胞类型改变离心力和离心时间；指南给出的参考标准是在12,000 rpm转速下离心20分钟，但须根据您的实验确定（白细胞所需的离心力很小）。

6.       轻轻地从离心机中取出离心管放置在冰上。将上清液吸出转移到放置在冰上预冷的新管中，弃去沉淀。

组织裂解液的制备

1.       用干净器械解剖目标组织，最好在冰上，并且越快越好以防蛋白酶降解。

2.       将组织放入圆底离心管或EP管中，浸入液氮中“速冻”。样本在-80°C储存备用，或放在冰上立即匀浆。对于一块约5mg的组织，向管中迅速加入约300 μL裂解液，并用电动匀浆器匀浆，2X裂解液冲洗刀片两次，每次200 μL，然后在4℃下（例如将回旋振荡器放入冰箱）持续振摇2小时。裂解液的体积必须根据组织总量决定；蛋白提取物不宜过稀释，以免造成蛋白损失，并尽量减少样本体积，以便凝胶上样。最小浓度为0.1 mg/mL，最佳浓度为1-5 mg/mL。

3.       在微型离心机中4℃下按照12,000rpm的转速离心20分钟。轻轻地从离心机中取出离心管放置在冰上。将上清液吸出转移到放置在冰上预冷的新管中，弃去沉淀。

样本制备

1.       取少量裂解液，用于蛋白质定量分析。测定每种细胞裂解液的蛋白质浓度。

2.       确定蛋白质的上样量，并添加等体积的2X稀释Laemmli样本缓冲液。

3.       对样本进行还原和变性时，将样本缓冲液中的细胞裂解液在100°C下煮沸5分钟。裂解液可等量分装并在-20°C下储存备用。

上样和跑胶

将等量的蛋白和分子量标志物上样至SDS-PAGE凝胶孔中。细胞裂解液或组织匀浆的总蛋白上样量为20-30μg，纯化蛋白的上样量为10-100ng。

在100V下跑胶1-2小时。距底部1/4处

蛋白从凝胶转移到膜

膜可以是硝酸纤维素，也可以是PVDF。用甲醇活化PVDF1分钟，并在制备转膜层之前用转膜缓冲液冲洗PVDF。转膜时间和电压根据指标大小优化。

转膜层的制备如下：

抗体染色

用封闭缓冲液在室温下封闭膜1-2小时或在4°C下封闭过夜。

用适当稀释的一抗在封闭缓冲液中孵育膜。我们建议在4°C下过夜孵育；其他条件可以优化。

用TBST洗涤膜3次，每次5分钟。

用推荐稀释度的偶联二抗在封闭缓冲液中室温孵育膜1小时。

用TBST洗涤膜3次，每次5分钟。

ECLReagent根据试剂商提供产品说明书使用

利用暗室显影技术采集化学发光图像，或利用常规图像扫描法采集比色检测图像。

8.      凝胶百分比取决于目标蛋白的大小：