Immunohistochemistry (IHC)SOP

Immunohistochemistry（IHC）SOP

原理：抗体和抗原之间的结合具有高度的特异性，免疫组织化学正是利用了这一原理。先将组织或细胞中的某种化学物质提取出来，以此作为抗原或半抗原，通过免疫动物后获得特异性的抗体，再以此抗体去探测组织或细胞中的同类的抗原物质。由于抗原与抗体的复合物是无色的，因此还必须借助于组织化学的方法将抗原抗体结合的部位显示出来，以期达到对组织或细胞中的未知抗原进行定性，定位或定量的研究。

注意事项：

为了避免因组织干透而导致的非特异性结合和高背景染色问题，孵育需要在湿盒中进行。在带密封盖的浅塑料盒底部垫上湿纸巾即可做成湿盒，切勿让载片接触纸巾，保持载片水平放置，避免试剂流出。

将塑料移液管切割成适合孵育室的长度，然后把这些移液管按两根一组粘在孵育室底部，每组间隔约4cm。这样可抬高载片平面，使载片不会接触到湿纸巾。

一抗和二抗的稀释倍数列于说明书数据表中，您也可通过预实验进行梯度稀释来确定最适宜的稀释倍数。建议您根据实验结果对稀释倍数进行适当优化。

酶偶联物相关方法中，辣根过氧化物酶(HRP)或碱性磷酸酶(AP)是最常用的两种酶，这些酶适用于多种显色底物。

方法

如有必要，请在开始免疫染色之前先执行抗原修复。

1.如果使用HRP偶联物进行检测，需要封闭内源过氧化氢酶，建议一抗孵育完成后再开始此操作。

H2O2可抑制内源性过氧化物酶的活性，达到降低背景染色的目的。为了验证这一现象，在一抗孵育前，可先用DAB底物进行显色。如果组织变为棕色，说明存在内源性过氧化氢酶，而封闭步骤很有必要。

但过氧化氢处理可能会修饰某些抗原表位，影响这些抗原与抗体的结合。在一抗孵育步骤后，再使用过氧化物孵育组织可避免这一问题，过氧化氢可使用TBS或水进行稀释。对于血液涂片或其它富含过氧化物酶的组织建议使用甲醇溶液；用甲醇稀释过氧化物还有助于减少水溶液引起的对组织的损伤。

对于其它组织，请使用TBS或水进行稀释。我们观察到甲醇/过氧化氢溶液孵育会导致某些抗体--抗原的结合有所下降，其中细胞表面蛋白质尤为明显。如果使用AP或荧光检测，则可不需要封闭过氧化氢酶，封闭过氧化氢酶仅适用于HRP偶联物。

2.在含0.025%TritonX-100的TBS溶液中洗涤载片两次并轻轻搅动，每次5分钟。

含0.025%TritonX-100的TBS溶液可降低表面张力，使试剂轻松覆盖整个组织切片。人们认为该溶液还可溶解Fc受体并减少非特异性结合。我们推荐使用TBS，而不推荐用PBS，以便获得更加清晰的背景。

3.使用含10%正常血清及1%BSA的TBS溶液室温封闭2小时。

二抗可能会与组织中的内源性免疫球蛋白发生交叉反应，使用产生二抗宿主来源的非免疫血清预处理该组织可最大程度减弱此反应。

在一抗孵育之前使用非免疫血清进行封闭可避免Fc受体与一抗和二抗的结合，此外,加入BSA能够减少疏水作用引起的非特异性结合。

4.除去组织上的的液体（请勿冲洗），然后使用纸巾擦拭载片周围。

5.加一抗孵育（用含1%BSA的TBS溶液稀释）。

将一抗稀释至厂家推荐的浓度或预实验确定的最佳浓度

一抗宿主应与所检测的组织来源不同,例如，如果使用小鼠组织，并且一抗也是来源于小鼠，则抗小鼠IgG二抗会与小鼠组织中的所有内源性IgG结合，并导致背景偏高。

6.在4℃下孵育过夜。
过夜孵育保证了抗体滴度较低或亲和力较弱的抗体

有充足的时间与抗原结合。无论抗体对其目的蛋白的滴度或亲和力如何，一旦组织达到饱和点，就无法结合更多抗体，孵育过夜可确保组织达到饱和。

7.在含0.025%TritonX-100的TBS溶液中洗涤载片两次并轻轻搅动，每次5分钟。

8.如果使用HRP偶联物进行检测，则将载片置于含0.3%H2O2的TBS溶液中孵育15分钟。

使用合适的显色底物显色。显色底物取决于取决于抗体所偶联的酶、您希望得到的显色产物，以及使用的是水性封片剂还是有机封片剂。

AEC、FastRed、INT或任何其它水性色原都是醇溶性的，请使用合适的水性封片介质，不需要进行脱水处理和清洗。

检测步骤

酶偶联物检测（根据试剂供应商说明书指导操作）

1.使用含1%BSA的TBS溶液稀释二抗，并将酶偶联二抗涂覆于载片上然后在室温下孵育1小时。

2.在室温下用显色底物显色约10分钟。

3.使用流动的自来水冲洗5分钟。

4.复染 常用的复染剂有苏木精（蓝色）、核固红或甲基绿。使用荧光检测时，可使用DAPI（蓝色）或碘化丙啶/PI（红色）。

5.脱水、清洗、和封片。

6.镜检