Super Tyramide – 647 Multiplex IHC Kit (Mouse source)Cat NO.: M-647

Protein names ：Super Tyramide – 647 Multiplex IHC Kit (Mouse source)

Reactivity ：Human,Rat,Mouse

• ApplicationDilution
• 免疫组化(IHC)1 kit
• The optimal dilutions should be determined by the end user

Storage ：自备试剂: 1× PBS Paraformaldehyde fixative（4% Paraformaldehyde in PBS） 0.5% Triton X-100 in PBS 0.1 M 柠檬酸钠缓冲液（pH 6.0） 3% H2O2：TSA H2O2制备母液（将90 µL的ddH2O加入10 µL 3％H2O2中。注：在使用当天准备新鲜的100X H2O2溶液，做到现用现配。） 封闭缓冲液：可将1 g BSA溶于100 mL含0.5% Triton X-100的PBS中配置成封闭缓冲液 DAPI染色液 样本准备 石蜡组织切片 将石蜡切片放置在 60℃的烘箱中 45-60 min。 室温下用二甲苯浸泡石蜡组织切片 2 次，每次 5 min， 以彻底脱掉石蜡。 注：二甲苯有毒，易挥发，请在通风橱中进行此操作。 室温下将切片样本浸没于无水乙醇中漂洗 2 次，每次 5 min。 室温下将切片样本连续浸没在不同浓度梯度的乙醇（95%、90%、80%、70%）中，每种浓度各漂洗 1 次，每次 1 min。 室温下将切片浸没于纯水中漂洗 2次，每次 3 min，再 将切片浸没于 1×PBS 中漂洗 1 次，每次 3 min，用滤纸小心 吸干切片样本周围多余液体。 用免疫组化笔在切片样本周围描绘样品轮廓，以便下游通透与标记。 抗原修复：将 0.1M 柠檬酸盐缓冲液（PH=6.0），用微波炉加热至沸腾，将脱完蜡及复水好的片子置于缓冲液中，间断煮沸 10 min。注意此过程中，玻片上组织要一直浸没于缓冲液中，以保证组织的抗原修复效果。抗原修复持续时间过后，取出放于室温中让其慢慢地降温。注：需根据不同的样本选择不同的抗原修复方法。 1× PBS 清洗两次。 内源性过氧化物酶灭活：通过加入足够量的 3％Hydrogen Peroxide 覆盖样 品并在室温下孵育20 min，淬灭样品的内源性过氧化物酶活性。 免疫标记 封闭：用封闭缓冲液室温封闭 30min。 用封闭缓冲液将一抗稀释至适当的浓度。将样品与一抗在室温下孵育 1-2h 或 4℃过夜。 室温下 1× PBS 洗涤 3 次，每次 5 min。 在封闭缓冲液中将 HRP-conjugated secondary antibody 以1：100 稀释。用该溶液在室温下孵育1 h。 室温下 1× PBS 洗涤 3 次，每次 5 min。 以后所有步骤均需避光 TSA Rea

Function ：原理：酪酰胺信号放大(TSA，Tyramide signal amplification)技术是一类利用辣根过氧化酶（HRP）对靶蛋白进行标记的酶学检测方法，类似常规免疫组化的DAB显色方法，TSA技术同样采用HRP标记的二抗，同样有对应的“显色”步骤（HRP催化加入反应体系的酪胺荧光素底物，产生活化荧光底物，活化底物可与抗原上的酪氨酸等残基共价结合，使样品上稳定的共价结合酪胺荧光素。之后用热修复法洗去非共价结合的一抗-二抗-HRP复合物，重复下一种一抗-hrp二抗来第二轮孵育，换另一种酪胺荧光素底物，如此往复就可实现多重标记。 TSA详细原理是利用酪胺Tyramide的过氧化物酶反应(酪胺盐在HRP催化H202下形成共价键结合位点)，产生大量的酶促产物，该产物能与周围的蛋白残基(包括色氨酸、组氨酸和酪氨酸残基)结合，这样在抗原-抗体结合部位就有大量的荧光素沉积，结果使其检测信号得到10-100倍增强。简单来说，用这种方法做多重免疫荧光是利用二抗上带有的HRP（而不是直接偶联荧光素），来催化后续添加入体系的非活性荧光素。Tyramide在HRP和过氧化氢的作用下被活化，跟临近蛋白的酪氨酸残基共价偶联，使得蛋白样品与荧光素稳定结合。然后微波或煮沸或者水浴等热修复处理，前一轮非共价结合的抗体被洗掉，共价结合的荧光素复合体稳定共价结合在样本蛋白上。再换个一抗来第二轮孵育，周而复始。等到所有抗体孵育结束，荧光素都结合好后，最后去检测结果。由于每次体系中都只有单一抗体孵育，因此无需担心抗体交叉反应，以及一抗二抗种属匹配问题，大大减少了实验设计时不同种属抗体选择匹配的限制。也就是说，如果用TSA技术，同一张片子上所有的靶标都可以选用同源抗体。搭配同一支HRP二抗就可以进行实验，而且信号放大的倍数大大增强。本公司开发的试剂盒具体酪胺荧光染料为一下其中一种或者多种：Super Tyramide -488，Super Tyramide -555，Super Tyramide -594，Super Tyramide -647，Super Tyramide -700。此试剂盒中的荧光染料可单独或配合使用。可以实现单标、双标、三标以及更多重荧光放大/多重同源抗体荧光标记等功能，极大丰富了此试剂盒的内涵。

IMPORTANT: For western blots, incubate membrane with diluted primary antibody in 1% w/v BSA, 1X TBST at 4°C overnight.